Spektrofotometria UV, VIS

Spektrofotometria, dział fotometrii obejmujący:
a) pomiary natężenia linii widmowych widm różnych substancji,
b) wyznaczanie krzywych absorpcji lub transmisji (przepuszczania) charakterystycznych dla substancji (jakościowa, i ilościowa analiza związków org., por. prawo Lamberta i Beera) oraz krzywych absorpcji filtrów świetlnych.
Jako metoda analityczna s. obiektywna (z komórką fotoelektryczną lub termoogniwem jako detektorem promieniowania) w zakresie podczerwień – promieniowanie widzialne (por. kolorymetria) – nadfiolet ma duże znaczenie. Krzywa zależności współczynnika ekstynkcji molarnej od długości fali charakteryzuje substancje, a wielkość absorpcji dla danej długości fali – jej stężenie. Przyrządami stosowanymi w s. są tzw. spektrofotometry, składające się ze źródła promieniowania, układu pochłaniającego (badanego i porównawczego), → monochromatora, detektorów promieniowania i urządzenia elektrycznego wzmacniającego i rejestrującego (lub pozwalające na in. formę odczytania wskazań detektora promieniowania).

Spektrofotometr
1. W analizie absorpcyjnej spektralnej aparat do pomiaru przepuszczalności lub wartości absorpcji promieniowania przy określonej dł. Fali. Ze względu na zakres pomiaru rozróżnia się:
a) Spektrofotometry na nadfiolet (za pomocą których po zmianie źródła promieniowania można prowadzić pomiary w świetle widzialnym) (a). wiązka promieniowania ze źródła 1, po odbiciu od zwierciadeł 2, 3, 4, rozczepia się w pryzmacie 5, zostaje zawrócona zwierciadłem 6 i po odbiciu od zwierciadła 4, przechodzi przez kiuwetę kuwetę próbką lub odnośnikiem (7, 7’) i pada na fotokomórkę 8. Układ opt. Wykonany jest z kwarcu.
Zamiast pryzmatu bywa stos. siatka dyfrakcyjna.
W zależności od sposobu pomiaru prądu fotokomórki rozróżnia się
s. z ręcznym nastawianiem dł. fali promieniowania (przez odpowiednie ustawienie pryzmatu lub siatki dyfrakcyjnej) i każdorazowym kompensacyjnym pomiarem prądu fotokomórki za pomocą potencjometru wyskalowanego wyskalowanego w jednostkach przepuszczalności lub wartości absorpcji oraz s. z automatyczną rejestracji krzywej absorpcji.

b) Spektrofotometry na światło widzialne zbudowane są wg ideowego schematu odpowiadającego s. na nadfiolet. Układ opt. wykonany jest ze szkła.

c) Spektrofotometry na podczerwień budowane są jako tzw. jednowiązkowe wg schematu ogólnego podobnego do opisanego powyżej, albo jak tzw. dwuwiązkowe (b), eliminując od razu z krzywej absorpcji absorpcję odnośnika oraz składników powietrza, przez które przebiega wiązka promieniowania. Wiązka promieniowania ze źródła 1, po odbiciu od zwierciadła 2, pada na dwa zwierciadła umieszczone nad sobą 3, 3’ i zostaje rozdzielona na dwie wiązki biegnące dalej równolegle jedna nad druga. Wiązki przechodzą odpowiednio przez kuwety z próbką i odnośnikiem 4, 4’ i po odbiciu od zwierciadła (5, 5’ i 6, 6’) ogniskują się w szczelinie 7. dalej odbijają się od zwierciadła 8, 8’ i 9, 9’, zostają rozszczepione i zawrócone w pryzmacie 10 i po odbiciu od zwierciadeł 9, 9’, przejściu przez szczelinę 7’ zostają za pomocą zwierciadła 11, 11’ zogniskowane na końcach podwójnej termopary 12, 12’. Zależne od badanego zakresu podczerwieni pryzmat wykonywany jest z monokryształu NaCl, KCl, KBr, LiJ i in. różnica prądów termopar rejestrowana jest automatycznie w sposób ciągły w postaci krzywej absorpcji.

Spektrofotometria UV – Vis
Spektrofotometria w zakresie nadfioletu (ang. ultra-violet – UV) i promieniowania widzialnego (ang. visible – Vis), czyli spektrofotometria UV – Vis jest jedną z najstarszych metod instrumentalnych w analizie chemicznej. Przedmiotem badań są widma elektronowe. Prawdopodobieństwo przejść elektronowych między poszczególnymi stanami energetycznymi cząsteczki określają tzw. reguły wyboru. Reguł tych jest kilka, a za podstawowe można uzyskać następujące:
a) Aby nastąpiła absorpcja promieniowania, muszą istnieć takie dwa stany kwantowe cząsteczki Ψm i Ψn’ których różnica energii odpowiada energii hv
promieniowania padającego:
En – Em = hn,m = ΔE
b) Absorpcja promieniowania musi być związane ze zmianą momentu dipolowego cząsteczki μ. W sposób ilościowy warunek ten opisuje tzw. moment przejścia między stanami elektronowymi, określający prawdopodobieństwo absorpcji dopasowanego, zgodnie z poprzednim warunkiem, fotonu:
Rn,m = ∫Ψn μ Ψm dτ
gdzie: Rn,m – moment przejścia,
Ψn’ Ψm – elektronowe funkcje stanów, między którymi zachodzi
przejście elektronów,
μ – moment dipolowy cząsteczki,
dτ – element objętości.
Przejście elektronowe dozwolone jest wtedy, gdy Rn,m ≠ 0
Przejścia spełniające reguły wyboru noszą nazwę przejść dozwolonych,
a niespełniające reguł wyboru – przejść wzbronionych. Miarą intensywności pasma absorpcji jest wartość molowego współczynnika absorpcji εmax przy długości fali w maksimum absorpcji λmax. Wartość εmax jest miarą prawdopodobieństwa przejścia i dla przejść wzbronionych ε przyjmuje małe wartości (rzędu kilku dm3 ∙ mol-1 ∙ cm-1), a dla przejść dozwolonych wartości duże do 1,5 ∙ 105 dm3 ∙ mol-1 ∙ cm-1.

Rodzaje przejść elektronowych
a) w związkach organicznych
b) w kompleksach metali d-elektronowych

Prawa absorpcji.
I Prawo absorpcji (prawo Lamberta)
Wiązka promieniowania monochromatycznego po przejściu przez jednorodny ośrodek absorbujący o grubości b ulega osłabieniu wg równania:
I = I0 ∙ e –kb
w którym I0 oznacza natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego padającego na jednorodny ośrodek absorbujący, I – natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący, b – grubość warstwy absorbującej, k – współczynnik absorpcji, e – podstawę logarytmów naturalnych.
I prawo absorpcji można zatem sformułować w sposób następujący:
Absorpcja jest proporcjonalna do grubości warstwy absorpcyjnej, jeśli wiązka promieniowania monochromatycznego przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.

II Prawo absorpcji (prawo Lamberta – Beera)
Prawo to dotyczy absorpcji promieniowania przez roztwór i można je sformułować w następujący sposób: jeśli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to wiązka promieniowania monochromatycznego, po przejściu przez jednorodny roztwór substancji absorbującej o stężeniu c, ulega osłabieniu według równania:
I – I0 ∙ e kbc
Prawo to można sformułować w sposób następujący: Jeżeli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to absorbancja wiązki promieniowania monochromatycznego przechodzącej przez jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalny do stężenia roztworu c i do grubości warstwy absorbującej b.

III Prawo absorpcji (prawo addytywności absorpcji)
Absorpcja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych składników:
A = A1 + A2 + … An
Gdzie: A1, A2, …, An są to absorbancje poszczególnych składników. W równaniu:
A = a c b
wielkość a jest właściwym współczynnikiem absorpcji, gdy stężenie wyrażamy w kg ∙ dm -3 lub g ∙ cm -3. Natomiast, gdy stężenie c wyrażamy w mol ∙ dm -3, równanie to przybiera postać:
A = ε c b
Gdzie ε jest to molowy współczynnik absorpcji, a jego wymiar podawany jest dwojako:
[dm3 ∙ mol -1].

Aparatura
Spektrofotometry UV – Vis to przyrządy do badania absorpcji promieniowania elektromagnetycznego w zakresie nadfioletu i części widzialnej widma.
Nie można w tym miejscu nie wspomnieć, że początków tej metody należy upatrywać w metodzie zwanej kolorymetrią, a pierwszymi przyrządami były wizualne kolorymetry – komparatory. Pomiar absorpcji promieniowania odbywał się przez porównanie intensywności zabarwienia dwóch roztworów, roztworów których jeden był roztworem wzorcowym, a drugi – roztworem badanym.
Przykładem jest wizualny komparator (kolorymetr) Dubosq’a, którego schemat przedstawiono na rys. 3.



Rys. 3. Schemat optyczny kolorymetru Dubosq’a;
1 – źródło światła, 2 – zwierciadło, 3, 4 – naczyńka pomiarowe, 5 – układ optyczny
6 – okular, 7 – szklane walce, b1, b2 – grubość warstw roztworu.

Światło wysyłane przez żarówkę (1) oświetla równomiernie dna naczyń pomiarowych (3, 4).
W jednym naczyniu jest roztwór wzorcowy. Światło po przejściu przez roztwór i układ optyczny (5) wpada do okularu (6), w którym pole widzenia jest podzielone linią na dwie połowy. Naczynia pomiarowe są umieszczone na wspornikach, które umożliwiają poziome podnoszenie i opuszczanie naczyń. Grubość warstw roztworów (b1, b2) reguluje się za pomocą szklanych walców zanurzonych w roztworach. Pomiar polega na doprowadzeniu obu połówek pola widzenia w okularze do oświetlenia o identycznym natężeniu. Znając grubość warstw roztworów b1 i b2 oraz stężenie c2, możemy obliczyć stężenie nieznaczne c1
z zależności:
c1 = c2 ∙ b2 b1

Podstawowymi częściami składowymi spektrofotometrów UV – Vis są:
a) źródło promieniowania,
b) monochromator,
c) pomieszczenie do umieszczenia komórki pomiarowej,
d) detektor mierzący natężenie promieniowania,
e) wskaźnik, rejestrator, komputer,
Ogólny schemat spektrofotometrów UV – Vis pokazano na rys. 4.



Rys. 4. Schemat blokowy spektrofotometru UV - Vis

Ad a) Źródło promieniowania
Źródło musi pokryć cały zakres UV – Vis, tzw. zakres od 180 do 800 nm.
Stosowane są:
1. Lampy deuterowi – w zakresie od 180 nm do 380 nm.
2. Lampy wolframowo-halogenowe – powyżej 380 nm, przez zakres widzialny i bliską podczerwień.
3. Wysokociśnieniowe łukowe lampy ksenonowe – są źródłem ciągłego promieniowania, pokrywającego cały zakres UV – Vis.

Ad b) Monochromator
Monochromator ma za zadanie wybrać, z emitowanego przez źródło ciągłego promieniowania, wąskie pasmo o żądanej długości fali i przepuścić je przez komórkę z badaną substancją. Monochromator składa się z:
1) szczeliny wejściowej,
2) kolimatora,
3) elementu rozszczepiającego promieniowanie,
4) szczeliny wyjściowej.


Ad c) Komórka pomiarowa
Absorpcję gazów i cieczy bada się w kuwetach. Kuwety pomiarowe powinny:
• zapewnić dokładnie znaną grubość warstwy absorbującej cieczy lub gazu:
• wykazywać odporność na działanie analizowanych substancji chemicznych;
• zapewnić w maksymalnym stopniu transmisję promieniowania.

Ad d) Detektory
Stosowane w spektrofotometrach UV – Vis detektory fotoelektryczne przetwarzają energię promieniowania elektromagnetycznego na energię elektryczną. Detektory powinny charakteryzować się:
• dobrą czułością, czyli niskim poziomem szumów własnych,
• szerokim zakresem liniowości wskazań, czyli proporcjonalnością przetwarzania sygnałów optycznych na elektryczne.
Z dużej grupy detektorów fotoelektrycznych w spektrofotometrach UV – Vis najczęściej są stosowane:
1) fotokomórki,
2) fotopowielacze,
3) fotodiody.

Z reguły w spektrofotometrach UV –Vis są zamontowane dwie wymienne fotokomórki:
• „niebieska” na zakres UV do 650 nm, z fotokadą antymonowocezową, antymonowocezową składzie Ag – stop Cs/Sb – Cs.
• „czerwona” na zakres powyżej 650 nm, z fotokadą zbudowaną z trzech warstw:
Ag – stop Cs/CsO – Cs.

Ze względu na sposób rejestracji spektrofotometry UV –Vis można podzielić na:
a) spektrofotometry punktowe, w których absorbancję mierzy się metodą wychyleniową lub kompensacyjną;
b) spektrofotometry samorejestrujące – rejestrują widma absorpcji w układzie
%T = f(λ) lub ε = f(λ), A = f(λ). Współczesne przyrządy tego typu zawierają układ komputerowy.


Inny podział spektrofotometrów wyróżnia:
a) spektrofotometry jednowiązkowe, w których jedna wiązka przechodzi najpierw przez roztwór odniesienia, a następnie, po zamianie kuwet, przez próbkę badaną.
b) spektrofotometry dwuwiązkowe, w których wiązka promieniowania ze źródła jest dzielona przez odpowiedni układ na dwie równocenne wiązki pochodzące równolegle – jedna przez roztwór, a druga przez roztwór badany. Detektor wskazuje różnice absorbancji.



Rys. 5. Schemat klasycznego spektrofotometru jednowiązkowego;
1 – źródło promieniowania, 2 – monochromator, 3 – szczelina, 4 – próbka, 5 – detektor




Rys. 6. Schemat spektrofotometru z matrycą diodową;
1 – źródło promieniowania, 2 – próbka, 3 – polichromator, 4 – detektor z matrycy diodowej
Obecnie coraz częściej dzieli się spektrofotometry UV –Vis na:
a) spektrofotometry klasyczne
b) spektrofotometry z detekcją równoległą za pomocą matryc diodowych.
Schematy blokowe spektrofotometrów klasycznych i spektrofotometrów typu diode arrays przedstawiono na rys. 5 i rys. 6. Wyraźnie widać różnice w biegu wiązki promieniowania:

• W spektrofotometrach klasycznych monochromator znajduje się przed próbką i przez próbkę przepuszcza się kolejne wiązki światła monochromatycznego, które sukcesywnie dochodzą do detektora.
• W spektrofotometrach z detekcją równoległą przez próbkę przepuszcza się promieniowanie polichromatyczne, a rozszczepienie wiązki promieniowania następuje po przejściu przez próbkę. Z kolei całe widmo pada równocześnie na matrycę fotodiodową i następuje równoległa detekcja.

Znajomość charakterystycznych cech spektrofotometrów UV –Vis pozwala na ocenę klasy przyrządu i jego wartości użytkowej. Przy ocenie takiej brane są pod uwagę różne parametry, a istotne znaczenie mają:
1) zakres spektralny przyrządu
Spektrofotometry budowane są na nadfiolet (UV) i zakres widzialny (Vis), przy czym niektóre przyrządy obejmuje także bliską podczerwień (NIR). Typowy zakres pomiarowy obejmuje przedział widma od 180 nm do 800 nm. Są jednak przyrządy o zakresie pomiarowym od 185 nm do 3000 nm oraz przyrządy o rozszerzonym krótkofalowym zakresie pomiarowym rozpoczynającym się od 165 nm.
2) Spektralna zdolność rozdzielcza (rozdzielczość)
Za miarę rozdzielczość spektralnej przyjmuje się najmniejszą możliwą do uzyskania
w danym przyrządzie szerokość spektralną wiązki przy danej długości fali.
Dla przyrządów różnej klasy wielkość ta jest zawarta w granicach od 1 nm do0,1 nm,
a wartością najczęściej spotykaną jest ≈ 0,1 nm.
3) Szerokość spektralna wiązki
Szerokość spektralna wiązki w spektrofotometrach UV – Vis jest różna, w przyrządach wysokiej klasy może mieć wartość 0,05 nm, a w przyrządach niższej klasy może wynosić 2 nm, 5 nm, a nawet 10 nm.


4) Dokładność skali absorpcji
Wielkość ta ma istotne znaczenie dla ilościowej oceny wyników i ma wpływ na dokładność i precyzję oznaczeń. Różne przyrządy pozwalają na odczyt absorpcji z różną dokładnością od ± 0,5 do 0,0008.
5) Procentowa zawartość światła rozproszonego
Światło rozproszone ma wpływ na odchylenia od praw absorpcji i w sposób istotny wpływa na zakres prostoliniowości wskazań przyrządu. Wielkość ta dla przyrządów niższej klasy może mieć wartość nawet 1%, a dla przyrządów wysokiej klasy ilość światła rozproszonego jest mniejsza od 0,00012%. Duża różnorodność spektrofotometrów UV – Vis znajdujących się w handlu pozwala wybrać przyrząd odpowiadający parametrami potrzebom danego laboratorium. Należy jednak pamiętać, że przyrządy te w zależności od klasy różnią się w sposób zasadniczy ceną.

Zastosowanie spektrofotometrów UV –Vis
Spektrofotometria UV – Vis należy do najczęściej wykorzystywanych metod instrumentalnych w analizie ilościowej. Główne zalety tej metody, to:
a) Dobra czułość
Obiektywnym liczbowym wykładnikiem czułości metod spektrofotometrycznych jest molowy współczynnik absorpcji ε, odpowiadający λmax badanego roztworu.
Wartości ε dla metod czułych wynoszą powyżej 10 000 dm3 ∙ mol -1 ∙ cm -1,
a współczynnik ε o wartościach poniżej 1000 dm3 ∙ mol -1 ∙ cm -1 odpowiada metodom mało czułym. Granicę oznaczalności w metodach spektrofotometrycznych określa się za pomocą współczynnika Wk, który wyraża wartość stężenia analizowanej substancji w μg ∙ cm -3, gdy grubość warstwy absorbującej b wynosi 1 cm.
b) Dobra precyzja oznaczeń
Precyzja oznaczeń zależy od zakresu oznaczonych stężeń i od klasy stosowanych
aparatów. W metodach spektrofotometrycznych można uzyskać wyniki, których błąd nie przekracza ± 0,2%.
c) Selektywność oznaczeń
Jest uwarunkowana selektywnością absorpcji z jednej strony i selektywnością odczynników wywołujących barwna reakcją z substancją oznaczoną z drugiej strony.
Te dwa czynniki pozwalają na osiągnięcie dobrej selektywności w szczególności w oznaczeniach kationów metali.
Możliwość praktycznych zastosowań metod spektrofotometrycznych UV – Vis
są różnorakie. A oto kilka przykładów takich zastosowań:
1) W analizie ilościowej kationów metali
2) W analizie ilościowej anionów nieorganicznych
3) W analizie ilościowej związków organicznych
4) Do badań równowag reakcji chemicznych
Spektrofotometrię UV –Vis wykorzystuje się w szczególności do:
a) wyznaczania stałych dysocjacji kwasów i zasad,
b) ustalania składu i stałych trwałości związków kompleksowych.


Spektrofotometr na nadfiolet


Spektrofotometr na podczerwień


Schemat optyczny kolorymetru Dubosq’a


Schemat fotopowielacza (U1, U2, U3 … Un – dynody)


Schemat klasycznego spektrofotometru jednowiązkowego

Schemat spektrofotometru z matrycą diodową

SCHEMATY I RYS. na dołączonym pliku!