Ambroży Kleks - bohater główny i tytułowy, nauczyciel i wychowawca chłopców z Akademii. Jest średniego wzrostu, bardzo lubi swoje bajecznie kolorowe i o wiele za duże od niego ubranie. Zwykle składa się ono z długiego surduta (długiej, obcisłej marynarki) koloru czekoladowego lub bordo (ciemnoczerwony, buraczkowy), bardzo szerokich spodni, aksamitnej kamizelki barwy cytrynowej oraz sztywnego kołnierzyka i olbrzymiej kokardy zamiast krawata. Osobliwości (coś wyjątkowego, nadzwyczajnego, rzadkiego) stroju pana Kleksa to: wielkie jak śliwki szklane guziki kamizelki, a także niezwykła ilość kieszeni. Jedna z nich jest umieszczona z tyłu surduta - to specjalne miejsce dla szpaka Mateusza. Warto przyjrzeć się twarzy pana Kleksa. Uwagę przyciąga zwłaszcza jego, ogromny, ruchliwy nos, na którym tkwią srebrne binokle (okulary bez uchwytów na uszy) w kształcie roweru. Pan Kleks nosi długie wąsy koloru pomarańczy i wspaniałą, gęstą brodę, czarną jak smoła. Jego oczy są mądre, a spojrzenie bardzo przenikliwe (tzn. pan Kleks wiele odgaduje, domyśla się i spostrzega, patrząc na jakąś osobę lub przedmiot). Głowę pana Kleksa porasta gęsta, rozwichrzona czupryna, która mieni się wszystkimi kolorami tęczy. Opisując twarz profesora, nie można zapomnieć o żółtych i czerwonych piegach. Pan Kleks uważa, że piegi znakomicie działają na rozum i chronią przed katarem, dlatego jego twarz jest nimi wprost upstrzona.
Pan Kleks to niezwykła postać. Potrafi wszystko: umie unosić się w powietrzu, powiększać przedmioty, leczyć chore sprzęty, ma doskonałą pamięć, przyrządza pyszne potrawy z kolorowych szkiełek i farb, choć sam żywi się pigułkami na porost włosów, które popija tajemniczym zielonym płynem. Kiedy ktoś zaginie, pan Kleks wysyła oko na oględziny (oglądanie, przegląd) i zguba zaraz się odnajduje.
Adaś Niezgódka - drugi z głównych bohaterów, jeden z uczniów Akademii, ma dwanaście lat i od pół roku jest uczniem pana Kleksa. Wygląda tak, jak większość dwunastoletnich chłopców - nosi szkolny mundurek Akademii, czyli granatową koszulę, długie białe spodnie, granatowe skarpetki i białe trzewiki. Wygląda czysto i schludnie. Przed pójściem do szkoły był ciamajdą i miał wielkiego pecha: w domu nic mu się nie udawało, zawsze spóźniał się do szkoły i nigdy nie mógł zdążyć z odrobieniem lekcji. Tłukł wszystkie szklane przedmioty, które złośliwie wymykały mu się z rąk. Zwykle Adaś nie znosił krupniku i marchewki, a często dostawał na obiad jako potrawy pożywne i zdrowe.
W Akademii jest jednym z najzdolniejszych uczniów. Szybko staje się pomocnikiem i prawą ręką profesora. Często jest wysyłany do innych bajek po różne sprawunki, przygląda się leczeniu chorych sprzętów, pomaga panu Kleksowi w kuchni, a w końcu towarzyszy profesorowi podczas ,,ożywiania" Alojzego. Adaś, jako jedyny spośród uczniów, wznosi się w powietrze. Odwiedza psi raj. On także do końca książki towarzyszy panu Kleksowi i obserwuje, jak zmienia się on w guzik oraz jak szpak zmienia się w autora książki.
Inni uczniowie - bohater zbiorowy, rówieśnicy Adasia, imiona wszystkich rozpoczynają się na literę "a": Adam, Andrzej, Aleksander, Artur. Są bardzo serdeczni i koleżeńscy, wspólnie przeżywają w Akademii wiele przygód. Bardzo kochają swego nauczyciela. Wszystkich uczniów jest w Akademii 24.
Szpak Mateusz - ulubieniec pana Kleksa. Kiedyś był księciem, synem potężnego króla i pięknej królowej, miał cztery siostry. Jego pasją była jazda konna. Kiedy Mateusz był siedmiolatkiem, ojciec zabronił mu jeździć konno i znalazł synowi doskonałych nauczycieli. Chłopiec bardzo dobrze się uczył, ale bardzo tęsknił za końmi, zwłaszcza ze swym ukochanym wierzchowcem Ali Babą. Pewnej nocy wyruszył na przejażdżkę i spotkała go nieszczęśliwa przygoda - zabił króla wilków, a sam został ranny. Wyleczył go doktor Paj Chi Wo, ale zemsta wilków była okrutna - zniszczyły kraj . Książę zdołał się uratować tylko dzięki czapce bogdychanów, która miała czarodziejskie właściwości. Pozwoliła mu zamienić się w szpaka. Niestety, zaginął guzik od magicznej czapki i książę nie mógł odzyskać dawnej postaci. Pozostał szpakiem, którego pewnego razu kupił pan Kleks. Stało się to na rynku w Salamance. Szpak Mateusz umie mówić, jednak wymawia tylko końcówki wyrazów. Jego przysmakiem są piegi. Odrabia z chłopcami lekcje i często zastępuje pana Kleksa. Na końcu książki szpak Mateusz zamienia się w... autora historii o panu Kleksie. Przyjmuje postać wytwornego (eleganckiego), czterdziestoletniego pana, o włosach lekko przyprószonych siwizną (o takich włosach mówimy ,,szpakowate").
Golarz Filip - jest golarzem, czyli fryzjerem. Dostarcza piegi pan Kleksowi, jest postacią tajemniczą i złowrogą, nawet profesor ulega jego żądaniu, aby w Akademii znalazł się Alojzy - lalka skonstruowana przez Filipa, którą pan Kleks zamienia w żywego chłopca. Chce zniszczyć pana Kleksa i jego Akademię.
Alojzy - okazuje się być lalką. Jest złośliwy, nieprzyjemny, dokucza kolegom, nie słucha poleceń pana Kleksa, wszystko niszczy i nie bierze udziału w życiu szkoły. Właśnie on niszczy sekrety pana Kleksa i doprowadza do zniszczenia całej Akademii.
Anatol Kukuryk - prawdziwy chłopiec i syn Filipa. Pojawił się pewnej nocy w Akademii wraz ze swoim bratem, Alojzym. Anatol jest miłym i grzecznym chłopcem, ale nie potrafi powstrzymać brata.
Paj Chi Wo - chiński uczony i lekarz. Wyleczył Mateusza i podarował mu cudowną czapkę bogdychanów. Przekazał całą swoją wiedzę panu Kleksowi.
Inżynier Bogumił Kopeć - wysoki, chudy mężczyzna z kozią bródką i rozwianymi włosami. Dyrektor fabryki dziur i dziurek, który w wolnych chwilach występuje w cyrku jako linoskoczek. Oprowadził chłopców po fabryce, jest dobrym znajomym Pana Kleksa, rozmawia z nim po chińsku i zna doktora Paj Chi Wo.
Reks - pies Adasia, którego chłopiec spotkał w psim raju.