Nieprawidlowosci uwarunkowane genetycznie i wady rozwojowe stanowia problem kliniczny w kazdej specjalnosci medycznej. Juz w pierwszych dobach zycia noworodka wykonywane sa testy przesiewowe w kierunku fenyloketonurii i wrodzonej niedoczynnosci tarczycy. Neonatolodzy i pediatrzy maja codziennie do czynienia takze z szeregiem innych wad rozwojowych, zaburzen metabolizmu czy tez innych chorób o podlozu genetycznym. Ogromne zapotrzebowanie na uslugi genetyczne powinni odczuwac ginekolodzy i poloznicy. Wady i nieprawidlowosci anatomiczne dróg rodnych, niepowodzenia rozrodu, przypadki nieplodnosci, wady rozwojowe u plodu itp., po wykluczeniu czestszych ich przyczyn wymagaja diagnostyki genetycznej.
Odrebna problematyke stanowi wspólpraca ginekologów i genetyków w zakresie szeroko pojetej diagnostyki przedurodzeniowej. Wrodzone dysfunkcje gruczolów dokrewnych i niedobory hormonalne, zalezne czesto od mutacji pojedynczych genów, wady narzadów plciowych i nieprawidlowosci determinacji plci, szereg klasycznych zespolów chorobowych w endokrynologii okreslaja znaczenie genetyki klinicznej w tej specjalnosci. Etiopatogeneza wad rozowojowych ukladu kostnego, chorobami ukladowymi w tym zakresie - chondrodysplazjami, chondrodystrofiami, achondroplazja moga byc zainteresowani ortopedzi lub radiolodzy.
Neurolodzy maja do czynienia na co dzien z wadami centralnego ukladu nerwowego, dystrofiami miesniowymi, rdzeniowym zanikiem miesni, nerwiakowlókniakowatoscia, powiklaniami neurologicznymi w przypadkach chorób metabolicznych itp. Okulista powinien przeprowadzic diagnostyke cytogenetyczna i molekularna chromosomu 13 w przypadkach retinoblastoma, zarówno pod katem prognostycznym u konkretnego pacjenta jak i celem udzielenia porady genetycznej w tym zakresie. Podobnie nefrolog moze poszukiwac powiazan guza Wilmsa ze stanem cytogenetycznym i molekularnym chromosomu 11. Hipercholesterolemia moze byc jej postacia wrodzona, wystepujaca rodzinnie, z koniecznoscia identyfikacji przez interniste innych obciazonych tymi zaburzeniami czlonków rodziny celem udzielenia im porady genetycznej i objecia opieka profilaktyczna. Zagadnieniem samym w sobie jest onkogenetyka, zarówno pod katem etiopatogenezy chorób nowotworowych jak i wlasciwego w tym zakresie poradnictwa genetycznego.
Teraz, po krótkim omówieniu, chcialbym przyblizyc metody badan i leczenia, jakie stosuje sie jedynie dzieki obecnosci takiej dziedziny wiedzy, jak cytogenetyka:
1. Cytogenetyka
Badania cytogenetyczne stanowia podstawe pre- i postnatalnej diagnostyki specyficznych chorób i zespolów klinicznych uwarunkowanych aberracjami chromosomowymi. Znanych jest ponad 400 takich zespolów. Specyfika badan cytogenetycznych polega przede wszystkim na koniecznosci prowadzenia hodowli komórkowych oraz bardzo trudnej, wymagajacej duzego doswiadczenia mikroskopowej analizie obrazu prazkowego chromosomów. Szczególna zas rola badan cytogenetycznych wynika z tego, ze ich wynik stanowi nie tylko podstawe dla prawidlowego rozpoznania choroby, lecz takze umozliwia identyfikacje rodzin ryzyka genetycznego. Badania te maja wiec zasadnicze znaczenie dla poradnictwa genetycznego (oceny ryzyka powtórzenia sie choroby w rodzinie), jak tez zwiazanej z nim profilaktyki chorób genetycznych. Wyjatkowa wage i znaczenie maja badania cytogenetyczne w diagnostyce prenatalnej chorób genetycznych. Ich wyniki niekiedy decyduja o dalszych losach ciazy. Szczególnie istotny jest w tych badaniach czas oczekiwania na wynik diagnostyczny i co sie z tym laczy ograniczenie mozliwosci jego weryfikacji.
Tylko te z wymienionych zagadnien sprawiaja, ze istnieje uzasadniona koniecznosc zapewnienia, tak z klinicznego jak i prawnego wzgledu, wysokiej skutecznosci i wiarygodnosci badan cytogenetycznych. Spelnienie tego wymogu nie jest mozliwe bez opracowania a nastepnie wdrozenia do praktyki odpowiednich, uwzgledniajacych specyfike badan cytogenetycznych, standardów metodycznych i organizacyjnych. W tym celu konieczne jest ustalenie i sformulowanie wymogów i zalecen dotyczacych zasad procedury diagnostycznej, stosowanie których zapewnialoby wysoki, w pelni profesjonalny standard badan cytogenetycznych. Zapewnienie takiego standardu wymaga prowadzenia systematycznej kontroli jakosci badan. Niezbedne jest stosowanie zarówno wewnatrz laboratoryjnego (polegajacego na ciaglym monitorowaniu jakosci wyników badan, wykrywaniu i rozwiazywaniu problemów technicznych i diagnostycznych), jak tez zewnetrznego systemu kontroli jakosci badan. Opracowanie takiego systemu wymaga ustalenia konkretnych zasad i kryteriów oceny jakosci badan cytogenetycznych dostosowanych do rodzaju badania. Postepujaca komercjalizacja uslug diagnostycznych stanowi dodatkowe wyzwanie do podjecia dzialan sluzacych zapewnieniu wysokiej jakosci prowadzonych badan cytogenetycznych.
W USA i wielu krajach zachodnioeuropejskich dzialaja juz systemy zewnetrznej kontroli jakosci (EQA od external quality assessment) badan diagnostycznych w zakresie genetyki klinicznej w tym badan cytogenetycznych. Wiekszosc z nich opracowana zostala na poczatku lat 90. w oparciu o zróznicowane, obejmujace merytoryczne, techniczne i organizacyjne standardy badan. Programy te opracowywane sa przez towarzystwa naukowe, organizacje zawodowe, Ministerstwa Zdrowia lub specjalnie powolane w tym celu zespoly fachowców. W niewielu tylko krajach jak np. w Wielkiej Brytanii systemy te maja formalny status programu narodowego. W nielicznych tez (Belgia, Holandia) wypracowane zostaly i juz obowiazuja systemy licencjonowania lub akredytacji laboratoriów cytogenetycznych. Jednak w przewazajacej wiekszosci krajów (np. w Danii, Austrii, Niemczech) nawet jesli nie funkcjonuja formalnie systemy EQA, to opracowane i wydane sa zalecenia dotyczace standardów obowiazujacych w cytogenetyce klinicznej.
Wyrazem ogromnej potrzeby wypracowania i ujednolicenia a w przyszlosci wprowadzenia jako obowiazujacych w krajach europejskich standardów tych badan jest opublikowanie w 1997 roku zalecen i standardów jakosci dotyczacych prenatalnych badan diagnostycznych. Opracowanie to powstalo w Louven (1996 r.) na zwolanym w tym celu posiedzeniu i jest wynikiem dyskusji i uzgodnien specjalistów róznych dziedzin genetyki klinicznej z 15 krajów europejskich. Zapewne w niedlugim czasie powstana podobne opracowania dla innych dziedzin cytogenetyki klinicznej (np. dla badan cytogenetycznych w diagnostyce chorób nowotworowych).
Staly postep jaki dokonuje sie w zakresie dbalosci o jakosc badan cytogenetycznych wyraza sie przede wszystkim coraz szerszym wprowadzaniem systemów EQA. Coraz czesciej i mocniej artykulowana jest potrzeba dzialan dotyczacych wymogu wprowadzania akredytacji laboratoriów cytogenetycznych. Modelowym przykladem organizacji i rozwoju systemu kontroli jakosci w cytogenetyce klinicznej jest brytyjski narodowy system UK NEQAS (National External Quality Assessment Schemes). Powstal on jako jeden z pierwszych tego typu systemów w 1982 roku i obejmuje retrospektywna ocene jakosci badan cytogenetycznych sluzacych przed- i pourodzeniowej diagnostyce aberracji konstytucyjnych oraz wystepujacych w nowotworach ukladu krwiotwórczego. Uczestnictwo w tym systemie oceny jest dobrowolne. Jak wskazuja coroczne raporty, nastepuje systematyczne doskonalenie jakosci badan cytogenetycznych. Rosna tez wymagania dotyczace minimalnych standardów okreslonych parametrów badan, co zmusza laboratoria do stalego doskonalenia stosowanej metodyki. Stanowi to równoczesnie dobrze dzialajacy mechanizm sluzacy uzyskiwaniu coraz lepszej jakosci badan diagnostycznych. Rozwój nowych metod i technik badawczych wymusza uwzglednienie ich w stosowanym juz systemie EQA czego przykladem jest wprowadzenie w 1997 roku pilotowego systemu oceny jakosci badan z zastosowaniem metod cytogenetyki molekularnej. W rok pózniej wprowadzono tez element oceny skutecznosci i wiarygodnosci diagnostycznej laboratorium (rozsylane sa do laboratoriów próbki testowe do oceny kariotypu) stanowiacy podstawe dla ustalenia czy laboratorium spelnia okreslone wymogi tzn. zapewnia badania o nalezytej jakosci. Wprowadzenie tego nowego testu warunkuje akredytacje EQAS przez Clinical Pathology a w przyszlosci akredytacje laboratoriów cytogenetycznych.
Realizowany juz od 1996 roku Powszechny Program Zewnetrznej Kontroli Jakosci w Medycynie Laboratoryjnej nie uwzglednia badan cytogenetycznych. Specyfika tych badan decyduje o koniecznosci opracowania dla nich odrebnego programu oceny jakosci. Niniejsze opracowanie stanowi propozycje takiego programu. Zawiera ono takze zasady analizy cytogenetycznej, stosowanie których jest warunkiem uzyskania odpowiedniego poziomu i wiarygodnosci diagnostyki cytogenetycznej chorób genetycznych.
2. Comet assay
Badania prowadzone na poziomie molekularnym dotycza wykrywania zmian indukowanych w DNA ludzkich limfocytów i wyrazanych w postaci uszkodzen spirali DNA. Do badan tych wprowadzono nowoczesna metode elektroforezy na zelu agarozowym uszkodzen DNA z pojedynczych komórek i detekcji ich metoda skomputeryzowanej analizy obrazu fluorescencjnego (Comet assay). Metoda elektroforezy DNA stosowana jest do oceny wzglednej (w odniesieniu do promieniowania X) skutecznosci biologicznej róznych wiazek terapeutycznych. Metoda ta jest stosowana równiez do oceny zróznicowania indywidualnej wrazliwosci osobniczej na promieniowanie X i UV oraz zdolnosci naprawczych zywych organizmów, a takze do badan mozliwosci podwyzszania efektywnosci procesów naprawy DNA.
3. FISH
Diagnostyka cytogenetyczna dotyczy tych schorzen uwarunkowanych genetycznie, które sa wynikiem aberracji chromosomowych. Wynik badania stanowi podstawe rozpoznania klinicznego choroby, umozliwia identyfikacje rodzin ryzyka i ma zasadnicze znaczenie dla poradnictwa genetycznego i profilaktyki aberracji chromosomowych. Stosowane dotychczas klasyczne metody badan cytogenetycznych sa czesto niewystarczajace dla pelnej oceny kariotypu i ustalenia rozpoznania. Wprowadzenie molekularnej techniki badawczej jaka jest hybrydyzacja in situ FISH poszerza znacznie zakres mozliwosci diagnostycznych badan cytogenetycznych. Technika FISH umozliwia identyfikacje tych typów aberracji chromosomowych, których okreslenie w badaniu konwencjonalnym bylo dotychczas niemozliwe, rozstrzygajac tym samym wiele problemów diagnostycznych. Uzyskany ta technika wynik badania decyduje niekiedy o wyborze postepowania leczniczego, np. zapobiegajacego rozwojowi procesów nowotworowych (gonadoblastoma).
4. Badania molekularne w rozpoznawaniu nowotworów
Materialem do oceny jest DNA pochodzacy z wycinków guza nowotworowego, komórek nowotworowych obecnych w plynach ustrojowych, wolnego surowiczego DNA pochodzacego z komórek nowotworowych lub leukocytów krwi obwodowej. Etapem wyjsciowym dla analizy genów jest amplifikacja fragmentów badanego DNA metoda reakcji lancuchowej z udzialem polimerazy - PCR (ang. polymerase chain reaction). Dalsze etapy moga dostarczyc informacji o zaburzeniach w obrebie genu.
Pierwsza kategorie informacji stanowi dokladna analiza mutacji, a metoda pozwalajaca na jej uzyskanie jest bezposrednie badanie sekwencji nukleotydów w uprzednio zamplifikowanych odcinkach genu. DNA mozna sekwencjonowac przez chemiczne rozrywanie lancucha przy okreslonych zasadach (metoda Maxama-Gilberta) lub przez kontrolowane zakonczenie replikacji (metoda Sangera). Ta druga metoda jest obecnie najczesciej stosowanym sposobem analizy DNA. W ostatnich latach opracowano odmiane metody Sangera, w której stosuje sie znakowanie fluorescencyjnie startery (primery) lub dideoksynukleotydy. Znakowane fluorescencyjnie produkty sekwencjonowania rozdziela sie w specjalnych aparatach zwanych „sekwenatorami” które automatycznie odczytuja sekwencje nukleotydów w DNA i zapisuja ja w pamieci komputera. Daje to mozliwosc blyskawicznej analizy uzyskanych danych i pozwala miedzy innymi na wykrywanie mutacji i polimorfizmów. Metody powyzsze sa bardzo czule i swoiste oraz pozwalaja na dokladna lokalizacje mutacji, a takze na okreslenie jej charakteru.
Inne metody umozliwiaja wykrycie mutacji bez jej pelnej charakterystyki. Do stwierdzenia obecnosci mutacji w okreslonym eksonie genu wykorzystuje sie metody posrednie, takie jak badanie polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA - SSCP (ang. single strand conformation polymorphism), elektroforeze w gradiencie denaturujacym - DGGE (ang. denaturating gradient gel electrophoresis) oraz analize heterodupleksów. Metoda SSCP oparta jest na zmianie konformacji (ksztaltu) pojedynczej nici DNA, bedacej wynikiem mutacji, co prowadzi do róznicy w migracji DNA w zelu poliakrylamidowym. Metoda DGGE oparta jest na zaleznej od skladu zasad zdolnosci denaturacji DNA w róznych temperaturach i stezeniach substancji denaturujacej. Analiza heterodupleksów polega na róznicy ruchliwosci podczas elektroforezy na zelu poliakrylamidowym heterodupleksów (struktur dwuniciowych DNA zawierajacych miejsca niesparowane z powodu mutacji punktowych) w porównaniu do homodupleksów (struktur dwuniciowych w pelni komplementarnych). Metody te sa latwiejsze do wykonania w porównaniu z bezposrednim sekwencjonowaniem genu, ale nie pozwalaja na pelne scharakteryzowanie mutacji.
Opracowano ostatnio metody, które daja mozliwosc wykrycia mutacji wystepujacych w bardzo malym odsetku badanej populacji komórek. Najczesciej taka analize przeprowadza sie stosujac technike „enriched-PCR” z jej modyfikacjami, alleloswoistej hybrydyzacji, oraz lancuchowej reakcji ligazy (LCR). Metody te sa wykorzystywane do wykrywania mutacji znanych, takich jak mutacje w kodonie 12 genu K-ras oraz mutacji w tzw. „goracych” miejscach w genie P53.
Metoda enriched-PCR polega na wybiórczej degradacji allela „dzikiego” przy zachowaniu allela zmutowanego przed amplifikacja genu w ukladzie PCR. W wyniku tego powstajace produkty PCR stanowia jednorodna populacje DNA pod wzgledem sekwencji nukleotydów, a obecnosc produktu amplifikacji swiadczy o obecnosci mutacji w badanym materiale. W przypadku, gdy oceniany na obecnosc mutacji kodon genu nie posiada miejsca ciecia dla zadnego ze znanych enzymów restrykcyjnych, w analizie enriched-PCR stosuje sie przed etapem ciecia matrycy dodatkowa amplikacje DNA ze starterami okreslonymi jako mismatched (metode te okresla sie jako PCR-PIREMA). W wyniku tego matryca genu prawidlowego bedzie przecinana przez enzym restrykcyjny, nie dajac produktu amplifikacji. Natomiast w genie zmutowanym takie miejsce ciecia nie powstaje, a amplifikowany gen swiadczy o obecnosci mutacji.
Metoda alleloswoistej hybrydyzacji polega na wykorzystywaniu alleloswoistych sond molekularnych w hybrydyzacji ze zamplifikowanym genem. W tej metodzie zazwyczaj stosuje sie technike dot-blotting, w której produkty amplifikacji nanoszone sa w postaci plamek na dwie blony nitrocelulozowe. Nastepnie jedna z blon jest hybrydyzowana z sonda o sekwencji prawidlowej, druga zas z sonda swoista dla sekwencji zmutowanej. Dodatni sygnal z sonda dla sekwencji zmutowanej swiadczy o obecnosci mutacji w badanej próbce.
W metodzie LCR stosuje sie powielanie in vitro fragmentu poprzez wielokrotne powtórzenie reakcji ligacji dwóch oligonukleotydów, która jest poprzedzona hybrydyzacja tych oligonukleotydów na jednej nici DNA. W metodzie tej stosowane sa oligonukleotydy komplementarne do zmienionej sekwencji i powielany jest gen zmutowany.