Tlen jest niezbędny organizmom tlenowym do przeprowadzania fosforylacji oksydacyjnej będącej najważniejszym etapem oddychania.
Organizm przeciętnego dorosłego człowieka zużywa około 0,3 g tlenu. Niedobór tlenu staje się niebezpieczny dla życia, gdy jego zawartość w powietrzu spada poniżej 12%.
Zwierzęta wykorzystują tlen w procesie oddychania tlenowego w celu otrzymania energii.
Tlen jest stosowany w medycynie, do sporządzania mieszanek oddechowych do nurkowania, w przemyśle jako utleniacz.
Ma ogromne zastosowanie w przemyśle, między innymi w hutnictwie do świeżenia metali